¿Qué es TCEP?

Tris (2-carboxietil) fosfina o por su nombre en inglés más conocido Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) es un agente reductor usado en investigación en biología molecular y bioquímica de proteínas.

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Estructura Química TCEP (PubChem ID: 119411)

Los investigadores con frecuencia adicionan TCEP para desnaturalizar proteínas durante la preparación de muestras protéicas para electroforesis. TCEP también ha sido útil para el almacenamiento de proteínas a largo plazo y la preparación de muestras en muchas otras aplicaciones tales como:

  • Conjugación y etiquetado de proteínas
  • Electroforesis Capilar con Deteción de Fluorescencia Inducida por Láser (en inglés CE-LIF)
  • Purificación de Proteína incluyendo Cromatografía
  • Aislamiento de ADN y ARN


Grupos Sulfihidrilo y Puentes Disulfuro en Proteínas

Los péptidos y las proteínas consisten en aminoácidos que se unen en enlaces peptídicos.


Los péptidos y las proteínas consisten en aminoácidos que se unen en enlaces peptídicos.


 Cuando dos grupos sulfihidrilo estan cerca uno del otro, ellos pueden formar un puente disulfuro (R-S-S-R’) por una reacción de oxidación.

Los grupos sulfihidrilo o tiols (R-SH) están presentes en proteínas conteniendo residuos de aminácidos de cisteína. Cuando dos grupos sulfihidrilo estan cerca uno del otro, ellos pueden formar un puente disulfuro (R-S-S-R’) por una reacción de oxidación.

Los grupos repetidos de residuos de cisteína y los puentes disulfuro están comúnmente presentes en los dominios extracelulares de receptores de unión a membrana. Muchas proteínas y péptidos excretados o secretados también tienen puentes disulfuro, incluyendo hormonas, enzimas, proteínas de plasma, inhibidores y proteínas venenosas. La estructura del puente disulfuro es importante para la función biológica de la proteína y la estabilización de la estrucctura secundaria y terciaria de la proteína.



proteina con puentes disulfuro

Desnaturalización de una Proteína. La adición de un agente reductor desintegra los puentes disulfuro y desnaturaliza la proteína.

Para estudiar la estructura y función de las proteínas, los investigadores con frecuencia analizan cada puente disulfuro como un fragmento enzimático y estudian como el puente se conecta con otros. Cuando los residuos de cisteína se agrupan de forma cercana, es duro de separar la cadena del péptido entre los puentes disulfuro.

Adicionar un agente reductor para romper las uniones disulfuro es una de las formas de resolver este problema. Un agente reductor es un compuesto que dona un electrón (o electrones) a otro compuesto. Algunos ejemplos de agentes reductores son TCEP, DTT, 2-mercaptoetanol, y 2-mercaptoetilamina.



TCEP y Reacciones de Reducción

TCEP es un reactivo efectivo para desintegrar los puentes disulfuro. TCEP es estable en soluciones acuosas, altamente reactivo, y selectivo hacia la estructura disulfuro.

TCEP y Reacciones de Reducción

Substitución Nucleofílica por el Átomo de Fósforo de TCEP. 1. El átomo de fósforo ataca un átomo de sulfuro en el enlace S-S. 2. Un catión tioalcoxyfosfonio y un anión sulfihidrilo son formados. 3. Una hidrólisis rápida libera la segunda molécula sulfihidrilo y el óxido fosfina.

Existen dos principales pasos en la ruptura de los puentes disulfuro y la formación de un sulfihidrilo libre usando TCEP:

  1. Desintegración del enlace S-S
  2. Oxidación de la fosfina y liberación del sulfihidrilo



Reacción de TCEP. 1. Ruptura del enlace S-S y formación de un compuesto conteniendo una estructura de puente disulfuro. 2. Liberación de las moléculas sulfihidrilo y formación de una fosfina oxidada.

Reacción de TCEP. 1. Ruptura del enlace S-S y formación de un compuesto conteniendo una estructura de puente disulfuro. 2. Liberación de las moléculas sulfihidrilo y formación de una fosfina oxidada.



¿TCEP o DTT?

  • Comparado con DTT y otros agentes reductores, TCEP tiene un olor más neutral y TCEP es más resistente a la oxidación por aire.
  • TCEP es un reductor útil con un amplio rango de pH (1.5-8.5) y es más estable que el DTT a un pH por encima de 7.5 (pH biológico).
  • La reacción de TCEP es irreversible, mientras la reacción de DTT es reversible.
  • Compared a DTT, TCEP es preferido para el etiquetado de residuos de cisteína con maleimidas. DTT contiene tioles y muestra reactividad con maleimidas, lo cual reduce la eficiencia de marcaje.
  • Puedes usar TCEP o DTT para etiquetar con yodoacetamida. TCEP y DTT sólo reducen la eficiencia de etiquetado de la yodoacetamida en una baja proporción. Pero el radio del colorante sobre la yodoacetamida, el pH, y la temperatura pueden afectar la eficiencia del etiquetado de la yodoacetamida.
  • TCEP es más estable que DTT en la presencia de iones metálicos (tales como Fe3+ y Ni2+). Puedes usar TCEP en vez de DTT para llevar a cabo cromatografía por afinidad ión-metal.
  • En la presencia de EGTA, la estabilidad de DTT incrementa, mientras que la de TCEP disminuye. La inestabilidad de TCEP es debida a que quelantes metálicos (como EGTA) catalizan la oxidación de TCEP.

Nota: TCEP no contiene tioles así que no hay necesidad de removerlo durante la reacción de etiquetado. Pero, TCEP puede reaccionar con maleimidas bajo ciertas condiciones, tales como, condiciones acídicas, a 20°C, y con la adición de mucho TCEP para el etiquetado de muestras proteómicas.

Si decides remover el exceso de TCEP antes de la adición de maleimidas, puedes usar:

- Diálisis

- Resina inmobilizada de TCEP

- Una columna cromatográfica

- Ácido 4-azidobenzoico



Buffers para Disolver TCEP

  • Puedes usar muchos tipos de buffers comunes durante la preparación de muestras de proteínas para disolver TCEP en un amplio rango de niveles de pH.
  • TCEP tiende a ser inestable alrededor de un pH neutral en buffers fosfato. Si requieres usar buffers fosfato con TCEP, prepárelo inmediatamente antes de usarlo

Por ejemplo, puedes preparar TCEP en:

- Buffer Tris-HCl para etiquetado y purificación de proteinas

- Buffer borate para fluorescencia inducida por electroforesis-láser

- Buffer Hepes para cromatografía



¿Cómo Preparar 0.5 M de Solución Stock TCEP?

1. Pese 5.73 g de TCEP (TCEP-HCL, GoldBio Catalog # TCEP)

2. Adicione 35 ml de agua grado biología molecular a un tubo y disuelva el TCEP. Esta solución resultante es muy ácida con un pH aproximado de This resulting solution is very acidic, with an approximate pH of 2.5.

3. Lleve la solución a un pH de 7.0 con 10 N de NaOH o 10 N de KOH.

4. Afore la solución resultante a 40 ml con agua grado biología molecular.

5. Haga alícuotas de 1 ml en viales de refrigeración y almacene a -20°C.

Nota: Este protocolo le permite prepara soluciones de trabajo y soluciones stock 10X de TCEP en el buffer de su elección antes de su uso. Puedes usar TCEP como sustituto de DTT a una concentración final de 50mM.

Nota: TCEP no puede ser usado para enfoque isoeléctrico debido a su carga en la solución.

Nota: Cubra los tubos con papel aluminio, debido que TCEP es sensible a la luz.

Nota: Las soluciones stock son estables por tres meses a -20°C.



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TCEP-HCL, Catálogo de GoldBio # TCEP



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Referencias

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Escrito por: Tyasning Kroemer, Ph.D.

Traducido por: Adriana Gallego, Ph.D.