Un ensayo indicador de luciferasa es un ensayo común en biología molecular que utiliza la enzima luciferasa y un sustrato (como luciferina) para estudiar la regulación génica a nivel de transcripción.

Algunas características importantes del ensayo de luciferasa (Brasier & Ron, 1992) son:

  • Extremadamente sensible
  • Reproducible
  • Compatible con reporteros de control interno
  • Uso de reactivos no radiactivos.

Este artículo proporciona información sobre el ensayo de luciferasa, incluyendo el proceso y los materiales que deberás preparar antes de realizar el ensayo.


¿Qué es un Ensayo de Luciferasa?

Un ensayo indicador de luciferasa es una prueba que investiga si una proteína puede activar o reprimir la expresión de un gen diana utilizando luciferasa como proteína reportera (Carter & Shieh, 2015). La síntesis de la proteína reportera y la adición de un sustrato dan como resultado una reacción química con bioluminiscencia (o emisión de fotones) como subproducto. Esta bioluminiscencia se corresponde directamente con el efecto de la proteína sobre la expresión del gen diana.

Ejemplos de mediciones de señales bioluminiscentes. Cuando una proteína de interés activa la transcripción, un luminómetro lee una señal bioluminiscente brillante. Sin embargo, si la proteína reprime la transcripción, el luminómetro no detectará ninguna señal.

Este tipo de ensayos pueden ayudarte a probar una conexión funcional entre una proteína y la cantidad de un producto génico, pero no pueden probar la interacción directa entre una proteína y una región reguladora de un gen diana (Carter y Shieh, 2015). .

Algunas aplicaciones de los ensayos de indicador de luciferasa son:

  • Análisis de expresión genética
  • Análisis de la estructura del promotor
  • Análisis de SNPs
  • Investigación y terapia antiviral
  • Ensayo de citotoxicidad
  • Descubrimiento de fármacos (tales como fármacos dirigidos a receptores acoplados a proteína G)


¿Cómo Funciona el Ensayo de Luciferasa?

Para realizar un ensayo de luciferasa, necesitarás un plásmido de ADN para expresar la proteína que, según tu hipótesis, podría afectar la transcripción.

funciona el ensayo de luciferase

You will also need to use another DNA plasmid with the regulatory element (or a target promoter region) fused with the DNA coding sequence for a luciferase enzyme. When activated, this system produces luciferase.



transcripcion: region promotora y luciferasa reportera

Después de que las células se transfectan con el plásmido indicador de luciferasa y se dejan crecer durante unos días, los siguientes pasos son: lisar las células, agregar un sustrato al lisado celular y medir la actividad de luciferasa en función de la cantidad de señal bioluminiscente.

Transfeccion - celula - adicion de tampon de lisis celular, transferencia a microplacas y adicion del sustrato

Ensayo de luciferasa. El ensayo es útil para estudiar si una proteína de interés regula un gen particular a nivel de transcripción. Por transfección, una construcción de ADN con el promotor del gen y una región codificante del gen indicador de luciferasa ingresa a las células. Otra construcción de ADN introducida en las células consiste en una región codificante de la proteína de interés. Cuando esta proteína activa la transcripción, la célula producirá la enzima luciferasa. Después de la adición de un tampón de lisis y un sustrato, un luminómetro cuantifica la actividad luciferasa.

Si su proteína activa la expresión del gen diana, aumenta la cantidad de señal producida. Sin embargo, si bloquea la expresión del gen, las células producen menos luciferasa. Como resultado, estas muestras generan una señal más baja que el control positivo.


¿Cómo elegir un tampón de lisis celular para el ensayo de luciferasa?

Al elegir un tampón para lisar las células para el ensayo de luciferasa, usa ingredientes que sean compatibles con los reactivos bioluminiscentes. Esto significa que el tampón debe poder proteger la actividad de la luciferasa, por lo que no interferirá con la actividad del reactivo bioluminiscente y la sensibilidad de la señal.

Por ejemplo, los tampones de lisis de luciferasa GoldBio retienen la sensibilidad de la señal y funcionan bien con nuestros kits de ensayo de luciferasa Illumination™. Para los ensayos de luciferasa Firefly, utilice un tampón de lisis de luciferasa, mientras que para los ensayos de luciferasa de Renilla, elija un tampón de lisis pasivo (TLP).


Cómo Hacer una Solución de Luciferina

Los sustratos comunes para el ensayo de luciferasa son luciferina y coelenterazina. Al preparar soluciones madre de luciferina, es útil prepararlas en un gran volumen para tus experimentos.


Preparación de una Solución Madre de D-Luciferina potásica o sódica

1. Prepare una solución madre de luciferina de 15 mg/ml (100X) en H2O de grado biología molecular.

Nota: Para obtener mejores resultados, la solución madre de luciferina debe usarse inmediatamente, pero puede separarse en pequeñas alícuotas y almacenarse a -80 °C hasta por 1 mes.

2. La concentración final del sustrato de luciferina en el ensayo de luminiscencia de luciferasa debe ser: 150 μg/ml (471 μM para la sal de luciferina potásica o 468 μM para la sal de luciferina sódica).


Preparando una Solución Stock de Coelenterazina

1. Agregue 1 mg de coelenterazina a 1 ml de metanol acidificado (agregue 50 µl de HCl concentrado a 10 ml de metanol).

2. Distribuya en alícuotas y almacene a -80 °C hasta por 4 semanas.

3. Para su uso, descongele el tubo y agregue 25,41 µl de solución madre de coelenterazina a 40 ml de DPBS (concentración final de 1,5 µM).


¿Cómo se mide la Actividad de la Luciferasa?

Para medir la actividad luciferasa de los lisados celulares, necesitarás una placa de múltiples pozos (como las usadas para PCR que tienen 96 pozos) o un tubo que contenga lisados celulares y un luminómetro. Este aparato detecta la emisión de fotones producida por la reacción de la luciferasa y la unidad de medida sale como unidades de luz relativa (ULR). Por lo general, para muchos ensayos de luciferasa, no es necesario seleccionar longitudes de onda particulares.

Para aumentar la consistencia de los resultados, es mejor utilizar un luminómetro con inyector (es) para tipos particulares de análisis de luciferasa (como análisis de luciferasa dual). El inyector dispensa un sustrato en el lisado celular y la lectura de los pozos comienza de inmediato para minimizar la posibilidad de disminución de la señal (Smale, 2010).


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Referencias

Badr, C. E., & Tannous, B. A. (2011). Bioluminescence imaging: progress and applications. Trends in Biotechnology, 29(12), 624–633. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2011.06.010.

Brasier, A. R., & Ron, D. (1992, January 1). [34] Luciferase reporter gene assay in mammalian cells. ScienceDirect; Academic Press. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/007668799216036J.

Carter, M., & Shieh, J. (2015, January 1). Chapter 15 - Biochemical Assays and Intracellular Signaling (M. Carter & J. Shieh (eds.)). ScienceDirect; Academic Press. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/...

Cheng, Z., Garvin, D., Paguio, A., Stecha, P., Wood, K., & Fan, F. (2010). Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways. Current Chemical Genomics, 4, 84–91. https://doi.org/10.2174/1875397301004010084.

Gong, D.-W., Bi, S., Pratley, R. E., & Weintraub, B. D. (1996). Genomic Structure and Promoter Analysis of the Human obese Gene. Journal of Biological Chemistry, 271(8), 3971–3974. https://doi.org/10.1074/jbc.271.8.3971.

Hampf, M., & Gossen, M. (2006). A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Analytical Biochemistry, 356(1), 94–99. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.04.046.

He, M., Guo, H., Yang, X., Zhang, X., Zhou, L., Cheng, L., Zeng, H., Hu, F. B., Tanguay, R. M., & Wu, T. (2009). Functional SNPs in HSPA1A Gene Predict Risk of Coronary Heart Disease. PLoS ONE, 4(3), e4851. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004851.

Matta, H., Gopalakrishnan, R., Choi, S., Prakash, R., Natarajan, V., Prins, R., Gong, S., Chitnis, S. D., Kahn, M., Han, X., Chaudhary, V., Soni, A., Sernas, J., Khan, P., Wang, D., & Chaudhary, P. M. (2018). Development and characterization of a novel luciferase based cytotoxicity assay. Scientific Reports, 8. https://doi.org/10.1038/s41598-017-18606-1.

Min, J. S., Kim, G.-W., Kwon, S., & Jin, Y.-H. (2020). A Cell-Based Reporter Assay for Screening Inhibitors of MERS Coronavirus RNA-Dependent RNA Polymerase Activity. Journal of Clinical Medicine, 9(8), 2399. https://doi.org/10.3390/jcm9082399.

Nakajima, Y., Kimura, T., Sugata, K., Enomoto, T., Asakawa, A., Kubota, H., Ikeda, M., & Ohmiya, Y. (2005). Multicolor luciferase assay system: one-step monitoring of multiple gene expressions with a single substrate. BioTechniques, 38(6), 891–894. https://doi.org/10.2144/05386st03.

Smale, S. T. (2010). Luciferase assay. Cold Spring Harbor Protocols, 2010(5), pdb.prot5421. https://doi.org/10.1101/pdb.prot5421.

‌Thorne, N., Inglese, J., & Auld, D. S. (2010). Illuminating Insights into Firefly Luciferase and Other Bioluminescent Reporters Used in Chemical Biology. Chemistry & Biology, 17(6), 646–657. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2010.05.012.

Escrito por: Tyasning Kroemer, Ph.D.

Traducido por: Adriana Gallego, Ph.D.

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